CAR-T生產(chǎn)工藝流程及優(yōu)化考量（上）

發(fā)布時間：2020-08-11 13:13 信息來源：閱讀次數(shù)：次

細胞毒性CD8+CART細胞，直接介導腫瘤細胞清除，但是CD4+輔助細胞(Th細胞)同樣有著重要作用。CD4+和CD8+CART應(yīng)該有一個合適的比例，有報道，治療B-ALL中，1：1會獲得產(chǎn)生更好的腫瘤消退療效。

調(diào)節(jié)性T細胞浸潤到實體腫瘤局部，會降低CD28-CD3ζ信號通路活性。去除CD28CAR胞內(nèi)段的Lck結(jié)合結(jié)構(gòu)域，即使在調(diào)節(jié)性T細胞存在的情況下，也有強抗腫瘤活性。

低分化的初始樣T細胞（na?ve-like T cells ，TN cells，表型CD45RA+ CD45RO- CD95-，CCR7+，CD62L+，CD28+，CD27+)和干細胞記憶樣T細胞（Stem cell memory-like T cells ，TSCM cells，表型CD45RA+ CD45RO- CCR7+CD95+)具有更強的增殖能力和自我更新能力，以及分化為效應(yīng)和記憶T細胞的能力，因而有產(chǎn)生更好臨床結(jié)果的潛能，更持久的抗腫瘤活性。

而分化的效應(yīng)樣T細胞（T effector-like cells，TEff cells，表型CD45RA+ CCR7-)雖然體外表現(xiàn)初強的抗腫瘤活性，但是在體內(nèi)，活化和增殖等能力均受損。

腫瘤高表達免疫檢查點配體，免疫細胞高表達免疫檢查點受體，則病人對于CART缺乏應(yīng)答。

T細胞需要表達淋巴組織歸巢分子（CCR7和CD62L），有助于浸潤到腫瘤局部，起到更好的治療效果。如上文，TN和TSCM表達歸巢受體，而Teff不表達歸巢受體。高表達CXCR2和GD2也有助于CAR-T浸潤到腫瘤組織。

1. 細胞分離和富集

分離方法：傳統(tǒng)方法Ficoll密度梯度離心用于去除顆粒細胞、紅細胞和血小板；自動化的分離系統(tǒng)：Sefia Cell Processing System，CliniMACS Prodigy。

基于CD3+進行細胞分選，然后以磁珠為基礎(chǔ)的技術(shù)如CliniMACS Prodigy，使用anti-CD3，anti-CD4，anti-CD8磁珠分選或者去除特定的細胞群，以獲得合理比例的CD4：CD8。

特定未分化的TN，TSCM，TCM細胞對于臨床是有益的，但是分選流程復(fù)雜，在實際生產(chǎn)流程中有一定困難。

2. T細胞激活

2.1anti-CD3/anti-CD28抗體活化

使用抗CD3（OKT-3單克隆抗體）/抗CD28抗體包被磁珠作為人工抗原提呈顆粒，anti-CD3提供增殖信號，anti-CD28提供共刺激信號。活化之后，磁珠可被磁鐵去除掉。

和可溶性O(shè)KT-3抗體相比，抗體包被磁珠活化細胞，具有更少的分化，更少衰老的特點。另外富集和清洗細胞會更加簡單，昂貴抗體的丟失更少。因而磁珠法是生產(chǎn)工藝中最常用的方法，如諾華的Kymriah。

最近一種特殊的聚合物納米基體產(chǎn)品(T Cell TransAct)，上面結(jié)合有人源化CD3和CD28抗體，結(jié)合使用無血清培養(yǎng)基(TexMACS)，用于T細胞活化。這種方法增加了高表達CD62L，CCR7的 TCM細胞，減少CD57+耗竭T細胞，但是不改變PD-1的表達和基因轉(zhuǎn)染效率，而且細胞裂解活性降低。

2.2 Retronectin

Retronectin是另外一種活化策略，使用重組纖維連接片段，同時可以增加逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染效率。Retronectin和板結(jié)合CD3抗體，或者anti-CD3/anti-CD28磁珠，用于GD2特異性CART和CD19特異性CART，增加TN和TSCM的比例。但是T細胞活化弱，擴增弱，細胞因子分泌少等是缺點。

2.3 人工APC細胞

人工APC遞呈TAA給CART，使其活化。比如使用K-562同時表達TAA和共刺激分子，不表達HLA-A，HLA-B，僅可用于TAA特異性CART活化。

3. 基因轉(zhuǎn)導系統(tǒng)

3.1病毒轉(zhuǎn)導

病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)轉(zhuǎn)染效率高，最常用的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒將病毒DNA整合到宿主DNA中，產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染。慢病毒需要調(diào)節(jié)基因來中和宿主細胞的防御，削弱免疫反應(yīng)，以及調(diào)節(jié)病毒復(fù)制。慢病毒載體，插入誘變和致癌的風險很低。

逆轉(zhuǎn)錄病毒生產(chǎn)需要大量的包裝細胞，而慢病毒載體生產(chǎn)需要大量質(zhì)粒DAN進行瞬時轉(zhuǎn)染。病毒的生產(chǎn)需要GMP級別的生產(chǎn)車間和一系列的檢測方法，是病毒轉(zhuǎn)染細胞最大瓶頸。

諾華的Kymriah® (Tisagenlecleucel)和施貴寶Lisocabtagene maraleucel (liso-cel; JCAR017)均使用慢病毒載體。Kite Yescarta (axicabtagene ciloleucel) 使用逆轉(zhuǎn)錄病毒。

3.2 基于質(zhì)粒的基因傳遞

轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)是一種替代的非病毒基因傳遞策略。采用“睡美人”轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)進行CART制造。該系統(tǒng)由兩個DNA質(zhì)粒組成，一個編碼CAR，第二表達轉(zhuǎn)座酶，這是切除和插入轉(zhuǎn)基因所必需的。這種方法不需要GMP車間生產(chǎn)病毒，成本低。在第一代CART和第三代CART中被使用，產(chǎn)品已經(jīng)開始在臨床實驗中使用。

3.3 基因編輯

CRISPR/Cas9能夠特異性地破壞多個基因的基因組基因座。CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合腺相關(guān)病毒(AAV)載體，將CAR的DNA整合入T細胞受體a，提高T細胞效力，抑制T細胞分化和衰竭。使用基因編輯和慢病毒轉(zhuǎn)導，用于產(chǎn)生PD-1缺陷的CD19特異性CART，增強抗腫瘤活性。

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