造成 C_T 值偏大的因素較多，主要分為以下兩大類情況：

（1）相同體系，前期實(shí)驗(yàn) C_T 值正常，本次實(shí)驗(yàn)，所有基因擴(kuò)增 C_T 值皆偏大。

這種情況下，需要排查 RNA 是否存在降解。如何判定 RNA 是否存在降解呢？可通過(guò) 1% 的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

完整度好的 RNA 是有三條帶的，以真核生物為例，三條帶分別是 28s、18s、5s，且 28s 條帶的亮度是 18s 的兩倍，5s 最暗（下圖左）。

如果 RNA 發(fā)生降解，會(huì)出現(xiàn)三條帶的亮度發(fā)生變化，甚至不存在完整的三條帶。如果 28s 幾乎看不到了，整個(gè)泳道 Smear 嚴(yán)重，說(shuō)明 RNA 的降解已經(jīng)很嚴(yán)重了，此時(shí) RNA 不建議用作后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)（下圖右）。重新提取 RNA 重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

（2）該基因第一次擴(kuò)增，其 C_T 值偏大，而其余基因的 C_T 值正常。

這種情況下就需要判定是因?yàn)?span style="font-size: 16px; font-family: arial, helvetica, sans-serif; margin: 0px; padding: 0px; max-width: 100%; color: rgb(95, 156, 239); box-sizing: border-box !important; word-wrap: break-word !important;">基因的擴(kuò)增效率低導(dǎo)致的 C_T 值偏大，還是基因本身的表達(dá)量低造成的 C_T 值偏大。

如何判定是因?yàn)榛虻臄U(kuò)增效率低導(dǎo)致的 C_T 值偏大，還是基因本身的表達(dá)量低造成的 C_T 值偏大呢？首先需要計(jì)算引物的擴(kuò)增效率。

可將基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋（至少三個(gè)梯度，且梯度之間的 △C_T 均一，防止因?yàn)椴僮髟驅(qū)е聵?biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系差，進(jìn)而影響擴(kuò)增效率的計(jì)算），同時(shí)進(jìn)行 qPCR。將得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行引物擴(kuò)增效率的計(jì)算。

關(guān)于引物擴(kuò)增效率的計(jì)算，可參考下面的案例：

① qPCR 擴(kuò)增：

將 qPCR 產(chǎn)物進(jìn)行原液、1/10、1/100 梯度稀釋，每個(gè)梯度設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，進(jìn)行 qPCR 擴(kuò)增，復(fù)孔間 C_T 值取平均值，得到三組 C_T 值。

② 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及擴(kuò)增效率計(jì)算：

可以在 excel 上進(jìn)行擴(kuò)增效率的計(jì)算。稀釋梯度可以設(shè)置為 -1、-2、-3，每個(gè)梯度對(duì)應(yīng)的 CT 值分別為 23.69、27.04、30.27，如下圖，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到線性方程（y = -3.29 x + 20.42）與 R² 值（R² = 0.9999）。將線性方程得到的斜率（-3.29）帶入擴(kuò)增效率計(jì)算公式中：，即可得到擴(kuò)增效率：101.35%。

只有當(dāng)擴(kuò)增效率滿足 90~120%，且標(biāo)準(zhǔn)曲線 R² ≥ 0.99，引物的擴(kuò)增效率才是合格的，定量出來(lái)的 C_T 值才可以用來(lái)計(jì)算。且擴(kuò)增效率越接近 100%，引物的擴(kuò)增性能越優(yōu)。

1. 若擴(kuò)增效率不滿足 90~120%，那 C_T 值偏大是因?yàn)閿U(kuò)增效率不達(dá)標(biāo)導(dǎo)致的，需要重新設(shè)計(jì)引物。

2. 若引物的擴(kuò)增效率滿足 90~120% 前提下，C_T 值仍然很大，則是基因本身表達(dá)量低造成的 C_T 值偏大，可以提高模板的添加量，但最根本的方法是改為探針?lè)ㄟM(jìn)行定量。探針?lè)ǖ撵`敏度是高于染料法的。

轉(zhuǎn)自：諾唯贊