4.  CART細(xì)胞結(jié)構(gòu)

CAR結(jié)構(gòu)包含

1. 抗體的單鏈可變區(qū)（scFv）
2. 非信號(hào)胞外區(qū)
3. 與scFv鏈接的鉸鏈區(qū)
4. 跨膜區(qū)
5. T細(xì)胞受體胞內(nèi)CD3ζ區(qū)
6. 共刺激因子結(jié)構(gòu)域

四代CAR的發(fā)展

• 第一代CART誘導(dǎo)T細(xì)胞激活僅通過(guò)cd3ζ信號(hào)域激活
• 第二代CART中增加了共刺激結(jié)構(gòu)域
• 第三代CART增加兩個(gè)共刺激結(jié)構(gòu)域
• 第四代CART增加酶、細(xì)胞因子和共刺激配體

5.  T細(xì)胞擴(kuò)增

在CART細(xì)胞擴(kuò)增過(guò)程中，細(xì)胞數(shù)量不斷增加，培養(yǎng)基體積增大，必須通過(guò)更多或更大的組織培養(yǎng)瓶，這極大地復(fù)雜化了制造過(guò)程，并且它無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)。

靜態(tài)培養(yǎng)袋，允許較少的手動(dòng)開放處理，管道連接可以使其在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

另一種方法 使用生物反應(yīng)器，如Xuri細(xì)胞擴(kuò)增系統(tǒng)和Wave生物反應(yīng)器系統(tǒng)，利用灌注機(jī)制添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及去除生長(zhǎng)抑制物質(zhì)，從而簡(jiǎn)化了制造過(guò)程。

6.  細(xì)胞因子刺激

細(xì)胞因子在工藝中使用，作為刺激信號(hào)，對(duì)于CART細(xì)胞質(zhì)量，表型等產(chǎn)生重要影響。主要是γ鏈細(xì)胞因子：IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21。常用IL-2 或者IL-7,同時(shí)使用/或者不適用IL-15.

諾華Yescarta使用IL-2，但是IL-2會(huì)導(dǎo)致分化和耗竭的T細(xì)胞表型。IL-7/IL-15可以增強(qiáng)T細(xì)胞活化和增殖，二者聯(lián)合使用可以增加未分化CART（TN，TSCM）的存活和維持。單獨(dú)添加IL-15也會(huì)增加耗竭表型，及抗凋亡活性。

和IL-2和IL-15比較，IL-21可以增加CD62L表達(dá)，增加抗腫瘤活性。

7.  抑制特定的信號(hào)通路

主要靶向GSK3β, mTOR, AKT, 和PI3K：

• GSK3β阻斷T細(xì)胞分化，產(chǎn)生更多的TSCM

• mTOR inhibitor rapamycin增加CD62L表達(dá)

• 體外AKT抑制劑也表現(xiàn)出增加T細(xì)胞抗腫瘤活性

• PI3K抑制劑idelalisib，降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫耐受，增加低分化CART細(xì)胞數(shù)量

8. 冷凍保存

冷凍保存CART細(xì)胞長(zhǎng)達(dá)90天，不影響細(xì)胞的活力。使用前37℃過(guò)夜，可以恢復(fù)CART細(xì)胞活力。