根據(jù)治療細(xì)胞的類(lèi)型，我們大致可以分為免疫細(xì)胞和干細(xì)胞，如下圖所示。

CAR-T細(xì)胞治療是一種以患者自身T細(xì)胞為基礎(chǔ)的治療，通過(guò)白細(xì)胞分離術(shù)收集患者的外周血單核細(xì)胞（PBMC細(xì)胞)，再分離出特定的T細(xì)胞亞群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T細(xì)胞。分離出的T細(xì)胞起始亞群需要持續(xù)和充分的激活才能實(shí)現(xiàn)體外擴(kuò)增，這就需要通過(guò)T細(xì)胞受體信號(hào)和CD28、4-1BB或OX40信號(hào)等共刺激信號(hào)產(chǎn)生主要的特異性信號(hào)，從而激活T細(xì)胞。再通過(guò)電穿孔、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將CAR基因?qū)爰せ畹腡細(xì)胞中進(jìn)行基因修飾，從而得到可表達(dá)CAR基因的CAR-T細(xì)胞（如下圖所示為整個(gè)CAR-T生產(chǎn)的流程）。

曾有報(bào)道，作為兩家CAR-T原研藥生產(chǎn)廠(chǎng)家，諾華的Kymriah和Kite制藥的Yescarta在早期CAR-T制備的失敗率都比較高，而這些失敗的原因中除了病人因?yàn)閭€(gè)體差異而導(dǎo)致失敗外，制備得到的CAR-T細(xì)胞質(zhì)量和數(shù)量也是很重要的因素。

3.1 T細(xì)胞刺激后體積監(jiān)控的重要性

由Springer（施普林格科學(xué)）公司于2017發(fā)行，題為Methods in Molecular Biology - Acute Myeloid Leukemia - Methods and Protocols （分子生物學(xué)方法 -急性髓細(xì)胞白血病-方法和方案）的參考標(biāo)準(zhǔn)方法流程中，刊登了一篇名為Generating and Expanding Autologous Chimeric Antigen Receptor T Cells from Patients with Acute Myeloid Leukemia，的文章（如左下圖），由幾位著名的T細(xì)胞高手(Saad S. Kenderian, Carl H. June, 和 Saar Gill)編寫(xiě)的急性髓細(xì)胞白血病自體Car-T細(xì)胞的生成和擴(kuò)增方法。

在3.1的＂從AML患者擴(kuò)增T細(xì)胞＂過(guò)程，由刺激日起計(jì)的第3天，每隔1天要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，保持細(xì)胞在1x10⁶細(xì)胞/mL。第6天磁珠轉(zhuǎn)移后，也需要進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

除了細(xì)胞計(jì)數(shù)外，還要通過(guò)庫(kù)爾特計(jì)數(shù)和粒度分析儀Multisizer來(lái)記錄平均細(xì)胞體積（MCV），因MCV上升等于T細(xì)胞被激活，而在被激活后的第5-7天達(dá)到最大。然后隨著T細(xì)胞開(kāi)始休息而下降。當(dāng)MCV變?yōu)?00 fL（通常在第9-14天范圍）時(shí)表明細(xì)胞得到了充分休息，可以進(jìn)行后續(xù)的冷藏或測(cè)試（如右下圖）。

通過(guò)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞的體積，比較不同CAR-T細(xì)胞及T細(xì)胞的平均體積差異，比較培養(yǎng)激活過(guò)程中的體積變化，幫助判斷細(xì)胞何時(shí)到靜息/穩(wěn)定狀態(tài)，另外幫助判斷細(xì)胞的激活強(qiáng)度，為研究做出科學(xué)判斷或決定下一步操作，如后期的功能檢測(cè)或冷凍保存等。

那么為何庫(kù)爾特法的Multisizer可以準(zhǔn)確地給出T細(xì)胞激活后體積的變化值呢？這是因?yàn)閹?kù)爾特法的原理，以及Multisizer配備了數(shù)字脈沖處理器（DPP），庫(kù)爾特的原理是通過(guò)檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞通過(guò)小孔時(shí)電壓的變化來(lái)精確記錄，并且換算得到每個(gè)細(xì)胞的體積，而配備的數(shù)字脈沖處理器，可以使得檢測(cè)的分辨率達(dá)到nm級(jí)別，所以可以對(duì)細(xì)胞體積的微小變化都能準(zhǔn)確的記錄下來(lái)。

另外，如果采用傳統(tǒng)的顯微鏡或其他圖像法儀器觀(guān)察細(xì)胞體積的變化，不僅看到的是二維的圖，并不能真正反映反映細(xì)胞整體真實(shí)的體積大小。并且細(xì)胞體積的微笑變化，體積表征相對(duì)細(xì)胞直徑的表征更加明顯。譬如，10um的細(xì)胞，直徑變大了5%，由于圖像法的分辨率差很難看出差異，但按體積計(jì)算，體積的增加能達(dá)到15.7%，加上Multisizer的DPP功能，可以實(shí)現(xiàn)所關(guān)注粒徑范圍最多400個(gè)粒徑分析通道（如下圖所示），真正實(shí)現(xiàn)高分辨地檢測(cè)體積的變化。

3.2 CAR-T細(xì)胞的數(shù)量和活率監(jiān)控

2019年在SCI Immunotherapy雜志發(fā)表了一篇重磅文章《TREM1/Dap12-based CAR-T cells show potent antitumor activity》中描述，體外培養(yǎng)擴(kuò)增過(guò)程中，除了使用Multisizer來(lái)檢測(cè)細(xì)胞體積外，細(xì)胞數(shù)量和活率的檢測(cè)也一樣重要。

不同處理得到的CAR-T細(xì)胞擴(kuò)增速率也是不同的，我們可以通過(guò)擴(kuò)增時(shí)間的比較來(lái)檢查細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的好壞，以此幫助分析得到合適的細(xì)胞培養(yǎng)條件和細(xì)胞處理方法。

另外，對(duì)于進(jìn)入生產(chǎn)化的細(xì)胞產(chǎn)品，所有的分析儀器都需要合規(guī)，包括來(lái)自FDA 21CFR Part11和GMP生產(chǎn)要求，儀器操作要有多級(jí)管理權(quán)限，操作和報(bào)錯(cuò)都必須存有電子記錄，Vi-CELL BLU對(duì)已經(jīng)考慮到了這些生產(chǎn)質(zhì)控的要求，所以分析軟件都能符合這些規(guī)定。

CAR-T細(xì)胞免疫治療的過(guò)程

CAR-T細(xì)胞免疫療法在近幾年來(lái)被越來(lái)越多大眾所了解，也有大量的生物制藥公司加入到CAR-T細(xì)胞免疫治療的隊(duì)伍，國(guó)外目前上市原研藥還是諾華的Kymriah和被吉利德收購(gòu)德Kite制藥德Yescarta。而國(guó)內(nèi)企業(yè)也在加緊研發(fā)和上市的步伐，其中復(fù)興凱特和藥明巨諾分別在今年的2月和6月遞交了上市申請(qǐng)。如下是這幾家公司CAR-T研發(fā)生產(chǎn)上市的進(jìn)展表。其中，作為國(guó)內(nèi)龍頭之一的南京傳奇也在全力地推動(dòng)產(chǎn)品的商業(yè)化，預(yù)計(jì)下半年會(huì)在美國(guó)遞交上市申請(qǐng)。