支原體能夠在特定的固體瓊脂培養(yǎng)基上形成經(jīng)典的“油煎荷包蛋”式的菌落，因此可以在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)支原體，通過觀察菌落形態(tài)以判斷是否存在支原體污染。這是最直觀的方法，也是最早的方法，但人們后來發(fā)現(xiàn)有很多支原體難以在固體培養(yǎng)基上形成菌落，因此，該法容易造成假陰性結果。

支原體在液體培養(yǎng)基中也能夠較好地生長，在支原體數(shù)目增長到一定程度之后，培養(yǎng)基中的PH值會發(fā)生顯著變化，如果在培養(yǎng)基中添加指示劑，這種變化會非常直觀地顯現(xiàn)出來。

單純的液體培養(yǎng)基檢測經(jīng)常受到指示劑加入量、變色范圍較小等因素的干擾。因此液體培養(yǎng)法和固體培養(yǎng)法通常一起使用，使檢測結果更加可靠。培養(yǎng)法的檢測時間在28天左右，時間較長。

大多數(shù)支原體的DNA中AT堿基的含量較高（55%~80%），DNA熒光染料Hoechst 33258或DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)可以結合到AT含量較高的DNA鏈上。所以在使用熒光染料染色后，被支原體污染的指示細胞除了細胞核發(fā)出熒光外，細胞表面、周圍培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿中也含有熒光小點。

為防止檢測結果出現(xiàn)細胞破裂后散出DNA等不確定因素造成假陽性或不清晰的實驗結果，通常會使用待檢測樣品的培養(yǎng)液，去感染易使支原體增殖的指示細胞（無污染的Vero細胞或經(jīng)藥品檢定機構認可的其他細胞），故又稱指示細胞法。

對于細胞粘附性比較差的支原體（精氨酸類支原體），染色法的檢出效果較差，所以在實際檢測過程中通常將染色法和培養(yǎng)法結合起來進行結果判定。

注：對可能引起指示細胞病變的且缺少有效中和抗體的高滴度病毒樣本來說，不能使用DNA染色法進行檢測。

相較于其他PCR技術，實時熒光定量PCR法可以通過觀察熒光擴增曲線的擴增情況來實時檢測支原體的污染情況，具有較好的特異性和準確性。并且不需要在PCR擴增后再進行凝膠電泳，縮短了實驗時間，降低了交叉污染的風險。

雖然支原體核酸擴增檢測法彌補了培養(yǎng)法和DNA染色法耗時長的缺點，也在一定程度上增加了檢測的靈敏度，但因其陽性檢出率往往受到引物所能擴增的支原體種類的制約，且容易受到樣品核酸提取方法、與支原體親緣關系較近的基因干擾等外源因素的影響。所以驗證每種支原體核酸檢測方法的檢測限(Detection Limit)、特異性(Specificity)、耐用性(Robustness)是非常必要的。